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021-50276769蛋白與配體能否結(jié)合、結(jié)合的強(qiáng)弱會(huì)直接影響蛋白檢測(cè)或純化實(shí)驗(yàn)的成敗。此篇文章由月旭科技首xi科學(xué)家王國(guó)斌博士執(zhí)筆，對(duì)蛋白結(jié)合和解離常數(shù)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的講述。
蛋白和配體結(jié)合的強(qiáng)弱不同，對(duì)于蛋白檢測(cè)以及親和分離純化實(shí)驗(yàn)有顯著影響。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮這種結(jié)合強(qiáng)弱影響，以便采用合適的蛋白或配體濃度（包括zui低檢測(cè)限濃度），估算結(jié)合時(shí)間，獲得最佳并且實(shí)用的結(jié)果。 這對(duì)于室溫下易失去活性，或希望盡可能保持最高活性蛋白的純化尤為重要。
常規(guī)的蛋白檢測(cè)方法，比如ELISA，只能測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的蛋白結(jié)合數(shù)值，不能跟蹤整個(gè)過(guò)程。這不利于獲取結(jié)合的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，阻礙了實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化。自從上個(gè)世紀(jì)90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技術(shù)后，目前已有幾種生物傳感器技術(shù)，能夠跟蹤蛋白和配基的real-time結(jié)合過(guò)程，檢測(cè)結(jié)合的全部過(guò)程，給出結(jié)合的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。下圖是我在SRU Biosystems用光學(xué)生物傳感測(cè)定蛋白A和不同濃度人類IgG隨時(shí)間變化的結(jié)合曲線。IgG濃度在100μg/mL時(shí)，結(jié)合在2-3分鐘內(nèi)迅速上升后，緩慢增加。在濃度減小時(shí)，結(jié)合速度變慢。濃度在6.25μg/mL時(shí)，結(jié)合在180分鐘內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地增加。濃度小于1μg/mL時(shí)，結(jié)合仍然進(jìn)行，但是十分緩慢。
絕大多數(shù)生化實(shí)驗(yàn)室，沒(méi)有real-time跟蹤檢測(cè)手段，蛋白檢測(cè)或者純化過(guò)程中，確定蛋白的濃度和結(jié)合時(shí)間通常根據(jù)結(jié)合的強(qiáng)弱來(lái)確定，而結(jié)合強(qiáng)弱是通過(guò)解離常數(shù)來(lái)判斷的。
在化學(xué)、生物化學(xué)中，解離常數(shù)（KD) 是一種反應(yīng)的平衡常數(shù)，用于測(cè)量較大物體可逆地分離（解離）成較小成分的傾向。解離常數(shù)是結(jié)合常數(shù)的倒數(shù)。 雖然解離常數(shù)是動(dòng)力學(xué)理論的參數(shù)， 但是它在生物化學(xué)，尤其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上有現(xiàn)實(shí)意義的指導(dǎo)作用。
對(duì)于一個(gè)可逆的蛋白結(jié)合過(guò)程
（1）P+L?P L
PL是蛋白P和配體L的親和產(chǎn)物。解離常數(shù)KD定義為
（2）KD=[P]e[L]e/[PL]_e=1/KA
其中[P]e’[L]e和[PL]e分別是到達(dá)平衡時(shí)，P、L和結(jié)合物PL的濃度。KA是結(jié)合常數(shù)。結(jié)合率?定義為蛋白P與配體L結(jié)合成PL的比例。
（3）?=[PL]_e/[P]t
[P]t是起始的蛋白P總濃度。平衡時(shí)蛋白濃度
（4）[P]e= [P]t-[PL]e
等式（2）變成
(5) KD=（[P]t-[PL]_e）[L]e/[PL]
等式（5）變成
(6) [PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
結(jié)合率?轉(zhuǎn)化為
（7） ?=[PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
平衡時(shí)省余未結(jié)合配體濃度
（8）[L]e=? KD/(1-?)
當(dāng)?shù)鞍譒有一半結(jié)合時(shí)，?=0.5
（9） [L]e=KD
最后平衡狀態(tài)結(jié)合配體的濃度就等于解離常數(shù)。下面闡述其實(shí)用價(jià)值。
例如KD為1nM時(shí)，最后剩余的配基平衡濃度為1nM，一半的蛋白會(huì)與配體結(jié)合（?=0.5）。KD為5nM時(shí)，最后剩余的配體平衡濃度為5nM時(shí)，一半的蛋白會(huì)與配體結(jié)合（?=0.5）。如果想要提高蛋白結(jié)合率到六成（?=0.6圖中紫線），就要增加配基濃度，達(dá)到最后配基平衡濃度分別為1.5nM（KD=1nM）和7.5nM（KD=5nM）。對(duì)于蛋白A填料來(lái)說(shuō)，配體就是抗體，不同動(dòng)物/總類的抗體有不同的KD。如果給與足夠時(shí)間，結(jié)合達(dá)到平衡后（靜態(tài)載量），沒(méi)結(jié)合抗體的濃度也不同。KD小，會(huì)有更高的靜態(tài)載量，分離得更*。 要想提高低KD抗體的載量，只能提高填料表面蛋白A的密度。如果時(shí)間短，沒(méi)有達(dá)到最后的結(jié)合平衡，現(xiàn)實(shí)的例子就是抗體流過(guò)蛋白A填料柱。在相同時(shí)間里，KD小的，會(huì)有更多的抗體與蛋白A結(jié)合。對(duì)于同樣的KD流速低，時(shí)間長(zhǎng)，動(dòng)態(tài)載量也會(huì)更高。
反之， 在最后配體平衡濃度為8nM（圖中紅線）時(shí)，KD小（1nM）的蛋白結(jié)合率能達(dá)到0.89，而KD大（5nM）的蛋白結(jié)合率只有0.62。 這對(duì)于無(wú)蛋白檢測(cè)時(shí)，試劑濃度選定有幫助。比如ELISA的二抗（檢測(cè)抗體）或者熒光標(biāo)記的二抗以及鏈霉親和素（Streptavidin）濃度確定后，KD對(duì)蛋白（被檢測(cè)物）的濃度測(cè)定的影響就顯而易見(jiàn)。KD小的被檢測(cè)蛋白，比如蛋白A或者蛋白A的填料，結(jié)合率高，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。如果KD較大，就要提高二抗?jié)舛龋源_保檢測(cè)數(shù)據(jù)可信度，或者縮短實(shí)驗(yàn)周期。
在分子生物學(xué)上，KD<10-8M (10nM或者0.01μM)屬于強(qiáng)結(jié)合； 10-4M>KD>10-8M屬于中等結(jié)合；KD>10-4M (0.1mM)屬于弱結(jié)合。蛋白A與不同種類抗體結(jié)合的強(qiáng)弱不同。例如protein A與人類IgG1、IgG2和IgG4的KD約為2×10?9M，屬于強(qiáng)結(jié)合。下表列出不同抗體與蛋白A結(jié)合的強(qiáng)弱情況。蛋白檢測(cè)，分離純化過(guò)程中，應(yīng)該參照結(jié)合強(qiáng)弱，設(shè)計(jì)操作方案。
鏈霉親和素（streptavidin）是生物化學(xué)常用的試劑。它于生物素（biotin）結(jié)合的KD非常小，僅為~10?14M。 強(qiáng)度與共價(jià)鍵類似。前文介紹過(guò)，鏈霉親和素是非常穩(wěn)定50KD蛋白，經(jīng)常用來(lái)與熒光、紅外、ELISA標(biāo)記等化學(xué)結(jié)合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，帶有羧基的小分子。 容易與蛋白化學(xué)結(jié)合。這樣帶有標(biāo)記的鏈霉親和素，與帶有生物素的蛋白結(jié)合，從而避免直接標(biāo)記蛋白。鏈霉親和素和生物素KD小。對(duì)比于直接標(biāo)記二抗的方法，采用標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素的方法用量小、時(shí)間短，達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。基于這種原因，標(biāo)記的鏈霉親和素、化學(xué)活化的生物素以及生物素結(jié)合的二抗等蛋白檢測(cè)試劑，比較容易購(gòu)買(mǎi)，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)非常便利。
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